人肝类器官构建实战 - 广州科珞捷生物技术有限公司-科珞捷生物聚焦于类器官（ORGANOID）技术的发展

注：涉及初级人体组织材料的研究必须遵循所有相关的机构和政府法规。在收集原始人体组织材料之前，必须获得所受试者的知情同意。

来自健康供体的肝脏类器官是了解肝脏发育和再生等肝脏生物学过程、模拟肝和其他肝脏疾病（如慢性和遗传性疾病）以及应用于再生医学（包括药物反应和移植）的理想模型。基因编辑、病毒感染和药物引入肝脏类器官可以模拟疾病的发生和发展过程。正常肝脏类器官是临床药物筛选、转化研究以及解毒和代谢研究的理想模型。

人肝类器官构建需要准备的试剂及耗材

试剂：人肝类器官试剂盒（Kinlogix:KOG02-HN）、基质胶（Corning:356231）、不含Ca+、Mg+的PBS（Kinlogix:M1013）、DMEM/F12培养基（Kinlogix:M1004）
耗材：24孔细胞培养板(非TC处理)、35mm细胞培养皿、24孔细胞培养板(非TC处理)、35mm细胞培养皿、50ml离心管、15ml离心管、1.5ml离心管、1ml枪头、200ul枪头、巴氏吸管、眼科镊、眼科剪、手术剪、冰盒或碎冰。

（人肝类器官培养试剂盒，详细见后表）

人肝类器官构建-预准备

1. 将Supplement A和Supplement B加入人肝类器官基础培养基组成人肝类器官培养基；

2. 将准备好的基质胶（推荐使用Corning:356231）提前放置在4℃冰箱提前过夜解冻；

3. 将5ml P1加入500ml 不含Ca+、Mg+的PBS中，配制成Buffer P1，并先放于4℃冰箱预冷；

将3ml P2加入100ml DMEM/F12培养基，配制成Buffer P2，并先放于4℃冰箱预冷；将24孔板置于CO2培养箱中预热(5% CO2，37°C)；（PS:本次演示使用3.5mm培养皿，可根据实验需要跟换培养器皿）

将冰盒装满碎冰，巴氏吸管，枪头提前放于4℃冰箱预冷。

人肝类器官构建-流程

1.将浸泡于组织活性保护液（Kinloigx:OG-005）中的人肝组织取出（Fig.1）；

2.在35mm皿中加入冰的Buffer P1，将人肝正常组织样本取出(Fig.2)，剔除脂肪组织以及坏死组织（Fig.3），转移至1.5ml离心管中，用冰的Buffer P1冲洗组织2-3次（Fig.4），用手术剪刀或者手术刀将人肝正常样本剪为1-2毫米小碎片（Fig.5）；

3.加入1ml冰的Buffer P1，轻柔吹打2-3次，让组织在重力作用下沉降 2-3分钟，去上清，再次加入1ml冰的Buffer P1清洗2-3次，去上清（Fig.6）；

4.加入1ml冰的Buffer P1重悬，加入100ul组织消化液C，置于37℃摇床上消化1h，每隔30min震荡仪上震荡混匀一次（Fig.7）；

5.待消化完成后（Fig.8），用1ml枪头上下吹打10次进一步消化组织，转移至15ml离心管中，加入9ml Buffer P2，并使用100µm 细胞过滤器过滤（Fig.9），1000rmp, 4°C离心5min，去除上清（Fig.10）；

6.若离心后发现有大量红细胞可用2ml红细胞裂解液重悬细胞团，放置2min，1000rmp,4°C离心5min，去除上清；

7.若并无过多红细胞可直接加入5ml Buffer P2重悬（Fig.11），1000rmp, 4°C离心5min，去除上清；

8.根据沉淀量加入相应体积的人肝类器官培养基与基质胶1:1.5重悬；

9.从37℃培养箱中取出提前2h放入的3.5mm培养皿，滴加50-100ul混合液，放入37℃培养箱5min（Fig.12），后倒置凝固20min（Fig.13）；

10.凝固后加入2ml人肝类器官培养基到3.5mm培养皿，置于细胞培养箱中进行培养，每天观察类器官生长情况，每隔2~3d更换培养液。

人肝类器官传代

小心吸出孔中的类器官培养基，加入1-2ml类器官传代消化液A，用移液枪吹散基质胶，转移到15ml离心管中；
将离心管置于摇床室温孵育15min；
加入10ml预冷Buffer P2重悬，1000rmp，4℃离心5min；
去除上清，以1:2-1:5传代，加入相应体积的人肝类器官培养基与基质胶1:1.5重悬，从37℃培养箱中取出提前2h放入的3.5mm培养皿，滴加50ul-100ul混合液，放入37℃培养箱5min后倒置凝固20min；
凝固后加入2ml人肝类器官培养基到3.5mm培养皿，置于细胞培养箱中进行培养，每天观察类器官生长情况，每隔2~3d更换培养液。

人肝类器官试剂盒-KOG02-HN

产品系列由广州科珞捷生物技术有限公司与广州沃亘生物科技有限公司联合研发类器官培养基产品系列

分离培养试剂盒——除类器官培养基外，另含组织分离缓冲液、组织消化液、细胞筛、传代消化液等。
培养基——基础培养基（100ml，4℃）、Supplement A（-20℃）、Supplement B（-20℃）注：