小鼠小肠类器官主要由小肠干细胞和小肠祖细胞组成。小肠类器官在自我更新和分化能力、组织结构、细胞类型和功能方面，重现了体内小肠上皮的特征，因此是小鼠小肠研究的理想体外模型。

小鼠小肠类器官构建需要准备的试剂及耗材

试剂：小鼠小肠类器官试剂盒（KOG03-MN）、基质胶（BD:356231）、不含Ca+、Mg+的PBS（Kinlogix:M10131）、D/F12培养基（11320033）

耗材：24孔细胞培养板(非TC处理)、35mm细胞培养皿、24孔细胞培养板(非TC处理)、35mm细胞培养皿、50ml离心管、15ml离心管、1.5ml离心管、1ml枪头、200ul枪头、巴氏吸管、眼科镊、眼科剪、手术剪、冰盒或碎冰

小鼠小肠类器官试剂盒（见文后表）

小鼠小肠类器官构建-预准备

1. 将Supplement A和Supplement B加入小鼠小肠类器官基础培养基组成小鼠小肠类器官培养基；

2. 将准备好的基质胶（推荐使用BD:356231）提前放置在4℃冰箱提前过夜解冻；

3. 将5ml P1加入500ml 不含Ca+、Mg+的PBS中，配制成Buffer P1，并先放于4℃冰箱预冷；

4. 将0.25ml P3加入250ml 不含Ca+、Mg+的PBS中，配制成Buffer P3，并先放于4℃冰箱预冷；将24孔板置于CO2培养箱中预热(5% CO2，37°C)；

5. 将冰盒装满碎冰，巴氏吸管，枪头提前放于4℃冰箱预冷。

小鼠小肠类器官构建-流程

1. 以颈椎脱臼法处死SPF级4-8周龄小鼠，用75%乙醇浸泡，转至无菌操作台；

2. 在小鼠的腹部的位置剪开外皮和内皮（Figure1 & Figure2），在无菌状态下取5-10cm左右小肠断（Figure3），置于10cm细胞培养皿中并加入15ml Buffer P1（Figure4），用镊子去除小肠肠表面黏膜与脂肪（Figure5），将枪头插入肠内用Buffer P1将内容物冲洗出来（Figure6），冲洗干净后使用眼科剪将小肠断纵向切开（Figure7）；

3. 将肠断腔面朝上，用Buffer P1反复冲洗，去除残留内容物，将肠组织置于新的含Buffer P1的培养皿中清洗，重复清洗一次；

4. 用眼科剪将小肠断剪成3~5 mm小块（Figure8）；

5. 将组织转入含15ml Buffer P1的50 ml离心管中（Figure9），用预冷巴氏吸管轻轻吹打清洗，静置待组织碎片沉淀后去上清，重新加入15ml Buffer P1重复清洗15-20次，直至上清液清亮，去除Buffer P1（Figure10）；

6. 将组织碎片用20ml PBS重悬，加入100ul组织消化液D，在冰上孵育30min，冰盒可放置于20rpm转速摇床上；

7. 孵育完成后静置沉降，去除上清，加入15ml冰的Buffer P3，用预冷巴氏吸管轻轻吹打2-3次，静置沉降，上清70uM细胞筛过筛，标记为1，再次加入15ml冰的Buffer P3，70uM细胞筛过筛，标记为2，再次加入15ml冰的Buffer P3，70uM细胞筛过筛，标记为3。再次加入15ml冰的Buffer P3，70uM细胞筛过筛，标记为4；

8. 取4支50ml离心管放置于超净工作台离心管架上，另取4个70uM细胞筛，打开包装后置于50ml离心管上（Figure11）；

9. 将4管过筛后的细胞悬液用冰冻离心机200g 4℃离心5min去除上清，再用预冷10ml Buffer P3重悬；

10. 从1,2,3,4上清中吸取10ul到3.5cm培养皿中观察隐窝数量，取隐窝较多，细胞碎片较少的进行类器官培养（推荐重悬密度为每10ul悬液包含200至600个隐窝）（Figure12 & Figure13 & Figure14 & Figure15 & Figure16）；

11. 将适合类器官培养密度的管数进行800rpm离心4min，加入适当的小鼠小肠培养基，并加入1.5倍的基质胶，轻轻重悬，避免吹打出气泡，拿出提前预热的24孔板，每孔滴入50ul；

12. 将24孔板反扣于37℃细胞培养箱静置（Figure17），15min后加500ul小鼠小肠类器官培养基到24孔板，置于细胞培养箱中进行培养，每天观察类器官生长情况，每隔2-3d更换培养液。

小鼠小肠类器官传代

1. 小心吸出孔中的类器官培养基，每孔加入1ml类器官传代消化液B，用移液枪吹散基质胶，转移到15ml离心管中；

2. 将离心管置于摇床室温孵育15min；

3. 加入10ml预冷Buffer P3重悬，300g 4℃离心5min；

4. 去除上清，以1:2-1:5传代，加入相应体积的小鼠小肠类器官培养基与基质胶1:1.5重悬，从37℃培养箱中取出提前2h放入的24孔板，每孔加50ul混合液，放入37℃培养箱5min后倒置凝固20min ；

5. 凝固后加入500ul小鼠小肠类器官培养基到24孔板，置于细胞培养箱中进行培养，每天观察类器官生长情况，每隔2~3d更换培养液。

小鼠小肠类器官试剂盒-KOG03-MN

类器官培养基产品系列

产品系列由广州科珞捷生物技术有限公司与广州沃亘生物科技有限公司联合研发

注：
培养基——基础培养基（100ml，4℃）、Supplement A（-20℃）、Supplement B（-20℃）
分离培养试剂盒——除基础培养基套装，另含组织消化液、分离缓冲液、传代消化液、细胞筛等。