产品介绍
产品介绍
Kinlogix Mouse Colonic Organoid Kit /Medium（小鼠小肠类器官分离培养试剂盒/培养基）是一款用于建立和维持小鼠小肠类器官的完全培养基及试剂。小鼠小肠类器官主要由小肠干细胞和小肠祖细胞组成。小肠类器官在自我更新和分化能力、组织结构、细胞类型和功能方面，重现了体内小肠上皮的特征，因此是小鼠小肠研究的理想体外模型。
*分离培养试剂盒适合从临床样本、原代组织开始的全流程操作；后续的传代培养只需购买培养基即可。
类器官分离培养试剂盒
组织消化液D
货号：OG-D3
规格：1ml
数量：1支
保存：4℃，2个月
P1
货号：OG-P1
规格：5ml
数量：1支
保存：-20℃，12个月，避免反复冻融
P3
货号：OG-P3
规格：0.5ml
数量：1支
保存：-20℃，12个月，避免反复冻融
小鼠小肠类器官培养基
货号：OG03-MN
规格：20ml
数量：5 瓶
保存：-20℃，12个月，避免反复冻融
类器官传代消化液B
货号：OG-G2
规格：1ml
数量：1支
保存：4℃，12个月
70um细胞筛
货号：OG-001
规格：个
数量：8个
保存：常温
红细胞裂解液
货号：OG-003
规格：10ml
数量：1支
保存：4℃，12个月
类器官构建
需额外准备的试剂及耗材
基质胶、不含Ca+、Mg+的PBS、D/F12培养基、24孔细胞培养板(非TC处理)、50ml离心管、1.5ml离心管、1ml枪头、200ul枪头、35mm细胞培养皿、巴氏吸管、眼科剪、眼科镊、冰盒。
预准备
1. 将小鼠小肠类器官培养基提前过夜解冻；
2. 将准备好的基质胶（推荐使用Corning:356231）提前放置在4℃冰箱提前过夜解冻；
3. 将5ml P1加入500ml 不含Ca+、Mg+的PBS中，配制成Buffer P1，并先放于4℃冰箱预冷；
4. 将0.25ml P3加入250ml 不含Ca+、Mg+的PBS中，配制成Buffer P3，并先放于4℃冰箱预冷；将24孔板置于CO2培养箱中预热(5% CO2，37°C)；
5. 将冰盒装满碎冰，巴氏吸管，枪头提前放于4℃冰箱预冷。
类器官构建操作
1. 以颈椎脱臼法处死SPF级4-8周龄小鼠，用75%乙醇浸泡，转至无菌操作台；
2. 在小鼠的腹部的位置剪开外皮和内皮，在无菌状态下取3-10cm左右小肠断，置于10cm细胞培养皿中并加入15ml Buffer P1，用镊子去除小肠肠表面黏膜与脂肪，将枪头插入肠内用Buffer P1将内容物冲洗出来，冲洗干净后使用眼科剪将小肠断纵向切开；
3. 将肠断腔面朝上，用Buffer P1反复冲洗，去除残留内容物，转移至新的10cm皿中加入15ml Buffer P1，一只手持手术镊夹住肠组织一端，另一只手持手术刀片轻轻刮去肠腔表面肠绒毛，待肠绒毛被刮净后，将肠组织置于新的含Buffer P1的培养皿中清洗，重复清洗一次；
4. 用眼科剪将小肠断剪成3~5 mm小块；
5. 将组织转入含15ml Buffer P1的50 ml离心管中，用预冷巴氏吸管轻轻吹打清洗，静置待组织碎片沉淀后去上清，重新加入15ml Buffer P1重复清洗15-20次，直至上清液清亮，去除Buffer P1；
6. 将组织碎片用20ml PBS重悬，加入100ul组织消化液D，在冰上孵育30min，冰盒可放置于20rpm转速摇床上；
7. 取4支50ml离心管放置于超净工作台离心管架上，另取4个70uM细胞筛，打开包装后置于50ml离心管上；
8. 孵育完成后静置沉降，去除上清，加入15ml冰的Buffer P3，用预冷巴氏吸管轻轻吹打2-3次，静置沉降，上清70uM细胞筛过筛，标记为1，再次加入15ml冰的Buffer P3，70uM细胞筛过筛，标记为2，再次加入15ml冰的Buffer P3，70uM细胞筛过筛，标记为3。再次加入15ml冰的Buffer P3，70uM细胞筛过筛，标记为4；
9. 将4管过筛后的细胞悬液用冰冻离心机200g 4℃离心5min去除上清，再用预冷10ml Buffer P3重悬；
10. 从1,2,3,4上清中吸取20ul到10cm培养皿中观察隐窝数量，取隐窝较多，细胞碎片较少的进行类器官培养（推荐重悬密度为每10ul悬液包含200至600个隐窝）；
11. 37℃静置15min凝固后加500ul小鼠小肠类器官培养基到24孔板，置于细胞培养箱中进行培养，每天观察类器官生长情况，每天更换培养液。
类器官传代
传代操作
1. 在20mlPBS中加入100ul类器官消化液B配置成类器官传代消化液B工作液;
2. 小心吸出孔中的类器官培养基，每孔加入1ml类器官传代消化液B工作液，用移液枪吹散基质胶，转移到15ml离心管中；
3. 将离心管置于摇床室温孵育15min；
4. 加入10ml预冷Buffer P3重悬，300g 4℃离心5min；
5. 去除上清，以1:2-1:5传代，加入相应体积的小鼠小肠类器官培养基与基质胶1:1.5重悬，从37℃培养箱中取出提前2h放入的24孔板，每孔加50ul混合液，放入37℃培养箱5min后倒置凝固20min ；
6. 凝固后加入500ul小鼠小肠类器官培养基到24孔板，置于细胞培养箱中进行培养，每天观察类器官生长情况，每天更换培养液。
