产品介绍
产品介绍
Kinlogix Human Intestinal Organoid Kit /Medium（人肠道类器官分离培养试剂盒/培养基）是一款用于建立和维持源自成体干细胞的人肠道类器官的完全培养基及试剂。人肠道类器官在结构、细胞类型组成和自我更新动力学方面显示出肠上皮的所有特征，可应用于生理学、疾病模型、致病基因研究、药物筛选与开发、再生医学等领域。
*分离培养试剂盒适合从临床样本、原代组织开始的全流程操作；后续的传代培养只需购买培养基即可。
类器官分离培养试剂盒
组织消化液D
货号：OG-D4
规格：1ml
数量：1支
保存：20℃，12个月，避免反复冻融
P1
货号：OG-P1
规格：5ml
数量：1支
保存：-20℃，12个月，避免反复冻融
P3
货号：OG-P3
规格：0.5ml
数量：1支
保存：-20℃，12个月，避免反复冻融
人肠道类器官培养基
货号：OG03-HN
规格：20ml
数量：5 瓶
保存：-20℃，12个月，避免反复冻融
类器官传代消化液B
货号：OG-G2
规格：1ml
数量：1支
保存：4℃，12个月
70um细胞筛
货号：OG-002
规格：个
数量：4个
保存：常温
类器官构建
需额外准备的试剂及耗材
基质胶、不含Ca+、Mg+的PBS、24孔细胞培养板(非TC处理)、50ml离心管、1.5ml离心管、1ml枪头、200ul枪头、35mm细胞培养皿、巴氏吸管、眼科剪、眼科镊、冰盒。
预准备
1. 将人肠道类器官培养基提前解冻；
2. 将准备好的基质胶（推荐使用Corning:356231）提前放置在4℃冰箱过夜解冻；
3. 将2.5ml P1加入250ml 不含Ca+、Mg+的PBS中，配制成Buffer P1，并放于4℃冰箱预冷；
4. 将0.25ml P3加入250ml 不含Ca+、Mg+的PBS中，配制成Buffer P3，并放于4℃冰箱预冷；
5. 将24孔板置于CO2培养箱中预热(5% CO2，37℃)；
6. 将冰盒装满碎冰，巴氏吸管，枪头提前放于4℃冰箱预冷。
类器官构建操作
1. 收集人正常肠道组织样本，马上置于组织保护液（OG-005）中，4℃保存；
2. 在35mm皿中加入预冷的Buffer P1，将人正常肠道组织组织样本取出，剔除表面黏膜与脂肪组织以及坏死组织，用手术剪刀或者手术刀将人正常肠道组织样本剪为3-5mm3小碎片；
3. 将组织碎片转入含15ml Buffer P1的50 ml离心管中，用巴氏吸管轻轻吹打清洗，静置待组织碎片沉淀后去上清，重新加入15ml Buffer P1，如此重复清洗10次，直至上清液清亮，去除Buffer P1；
4. 将组织碎片用10ml PBS重悬，加入50ul组织消化液D，在冰上孵育30min，冰盒可放置于20rpm转速摇床上；
5. 孵育完成后的组织碎片静置沉降，去除上清，加入15ml Buffer P3，用巴氏吸管轻轻吹打重悬2-3次，取上清悬液用70um细胞筛过筛，过筛后取20uL细胞悬液进行镜检和隐窝计数；
6. 用冰冻离心机以200g离心力 4℃离心5min，弃上清后置于冰上，
7. 根据沉淀量加入相应体积的人肠道类器官培养基与基质胶1:1.5重悬混匀（推荐重悬密度为每10ul混匀液包含200至600个隐窝），此步操作需全程置于冰上；
8. 从37℃培养箱中取出提前2h放入的24孔板，用预冷的枪头取混匀液按每孔50ul种入（建议点入24孔板每孔底部正中央，避免混匀液接触孔板侧壁），放入37℃培养箱5min后倒置凝固25min；
9. 凝固后每孔加入500ul人肠道类器官培养基到24孔板，置于细胞培养箱中进行培养，每天观察类器官生长情况，每天更换培养液。
类器官传代
传代操作
1. 将250ul类器官传代消化液B加入49.75ml不含Ca+、Mg+的PBS中，配置成工作液，4℃保存3个月；
2. 小心吸去孔中的类器官培养基，每孔加入1ml类器官传代消化液B工作液，用移液枪轻柔吹散基质胶，收集悬液转移到50ml离心管中；
3. 将离心管置于摇床室温孵育15min；
4. 加入等体积6预冷Buffer P3重悬，300g 4℃离心5min，去除上清置于冰上；
5. 用人肠道类器官培养基 重悬（推荐传代比例为1:2-1:5），将悬液和基质胶以1：1.5比例混匀（此步操作需全程置于冰上），用预冷的枪头取混匀液按每孔50ul种入提前预热的24孔板中；
6. 凝固后每孔加入500ul人肠道类器官培养基到24孔板，置于细胞培养箱中进行培养，每天观察类器官生长情况，每天更换培养液。
